Μεθοδολογία έργου ΕΛΙΑΔΑ
Δείγματα 25 σημαντικών Ελληνικών ποικιλιών ελιάς από τους καρπούς, τα φύλλα και τα ενδοκάρπια θα χαρακτηριστούν μορφολογικά υπολογίζοντας διάφορα χαρακτηριστικά (όπως επιφάνεια, ύψος, πλάτος, σχήμα, παρουσία ή όχι θηλής, επιφάνεια θηλής, αδρότητα ενδοκαρπίου, σχήμα κορυφής φύλου κ.α.). Κάτω από συγκεκριμένες συνθήκες φωτισμού και σκίασης, θα παραχθούν φωτογραφίες- δεδομένα για την εξαγωγή των μετρήσεων από έναν αντιπροσωπευτικό αριθμό δειγμάτων (καρποί, φύλλα και ενδοκάρπια), που θα μας επιτρέψει να εξάγουμε ασφαλή συμπεράσματα, κατόπιν στατιστικής ανάλυσης. Μέσα από μια τέτοια σε βάθος στατιστική ανάλυση θα αξιολογηθούν κλώνοι ποικιλιών με ιδιαίτερα χαρακτηριστικά παραλακτικότητας εντός της ποικιλίας. Χρησιμοποιώντας και αναπτύσσοντας περαιτέρω ημί–αυτόνομες, καινοτόμες μεθοδολογίες, θα ποσοτικοποιήσουμε τα μορφολογικά χαρακτηριστικά των καρπών, των φύλων και των πυρήνων της κάθε ποικιλίας. Η ίδια διαδικασία θα ακολουθηθεί και για τον φαινοτυπικό χαρακτηρισμό της F1 γενιάς των διασταυρώσεων που θα γίνουν στην ΕΕ4 όταν τα σπορόφυτα εισέλθουν σε καρποφορία. Tα δείγματα θα αναλυθούν και θα χρησιμοποιηθούν για την δημιουργία μιας βάσης δεδομένων η οποία θα αποτελέσει τον φαινομικό άτλα με τα μορφολογικά χαρακτηριστικά της κάθε ποικιλίας και κλώνων, και θα αναπτυχθεί σε open source περιβάλλον όπως π.χ. SQL. Από τις ποικιλίες και τα εμβολιασμένα δενδρύλλια θα παραχθούν μονοποικιλιακά ελαιόλαδα με την χρήση ενώ τα ποιοτικά χαρακτηριστικά θα προσδιοριστούν από διαπιστευμένο εργαστήριο-υπεργολάβο με τεράστια εμπειρία στην ανάλυση ελαιολάδων (AGROLAB). Γενωμικό DNA από τις υπο ανάλυση Ελληνικές ποικιλίες ελιάς θα χρησιμοποιηθεί για τον γενετικό χαρακτηρισμό με την χρήση ειδικών (standardized) μοριακών δεικτών SSRs όπως DCA3, DCA5, DCA9, DCA16 και DCA18. Ο χαρακτηρισμός θα γίνει χρησιμοποιώντας τριχοειδή ηλεκτροφόρηση (capillary electrophoresis). Δενδρόγραμα θα κατασκευαστεί για τον προσδιορισμό της γενετικής συγγένειας. Ταυτοποίηση γενοτύπων (in depth analysis) θα γίνει με συνδυασμό μοριακών δεικτών SSRs ή και SNPs (Single Nucleotide Polymorphisms) εάν χρειαστεί.
Επιπρόσθετα, από τους σπόρους-προϊόντα των διασταυρώσεων θα εξαχθούν τα έμβρυα και θα καλλιεργηθούν για παραγωγή σπορόφυτων. Τα σπορόφυτα θα κλωνοποιηθούν με την χρήση ιστοκαλλιέργειας και θα χρησιμοποιηθούν για in vitro έκθεση σε συνθήκες αβιοτικής καταπόνησης με στόχο τον προσδιορισμό γενοτύπων με μεγαλύτερη αντοχή σε αυτές τις συνθήκες. Μία άλλη παράμετρος για την επιτυχία του μίκρο-πολλαπλασιασμού είναι η αντίδραση της κάθε ποικιλίας στη σύνθεση του θρεπτικού μέσου. Οι Varlaro et al. μελέτησαν την επίδραση των θρεπτικών μέσων ΟΜ και MS στην ανάπτυξη ορισμένων ποικιλιών ελιάς που προέκυψαν με τη μέθοδο των πλευρικών οφθαλμών και τα αποτελέσματά τους υποδεικνύουν ότι μια ποικιλία μπορεί να επιδείξει διαφορετική συμπεριφορά σε δυο θρεπτικά. Μια υποσχόμενη βελτίωση στον πολλαπλασιασμό από βλαστό επιτεύχθηκε γενικότερά σε τροποποιημένο MS θρεπτικό μέσο, όπου η πηγή άνθρακα από σουκρόζη αντικαταστάθηκε σε μαννιτόλη.
Φυτά 2 και 3 ετών έχουν φυτευθεί σε ειδικά βαρέλια ύψους 90 εκατοστών για πλήρη ανάπτυξη του ριζικού συστήματος για τουλάχιστον ένα έτος προσομοιάζοντας συνθήκες καλλιέργειας ελαιώνα και θα καταπονηθούν υπό συνθήκες ξηρασίας. Επιπρόσθετα, φυτά από τις ανθεκτικές και ευαίσθητες ποικιλίες που θα παραχθούν μέσω αγενούς πολλαππλασιασμού in vitro θα εκτεθούν σε συνθήκες έλλειψης οξυγόνου μόνο για το ριζικό τους σύστημα σε ειδικά δοχεία με περλίτη που θα κατασκευασθούν για αυτόν τον σκοπό προσομοιώνοντας συνθήκες πλημμύρας. Η έκθεση σε χαμηλές θερμοκρασίες θα γίνει με τοποθέτηση των φυτών σε ειδικούς θαλάμους που μπορούν να πετύχουν θερμοκρασίες 4°C ή και χαμηλότερες, 0°C. Ρυθμιστικά δίκτυα γονιδίων θα παραχθούν και μεταγραφικοί παράγοντες θα προσδιοριστούν με αποδειγμένο ρυθμιστικό ρόλο μετά από συγκριτική γονιδιωματική. Η δυναμική της έκφρασης των γονιδίων που επάγονται σε κάτω από συνθήκες ξηρασίας θα επαληθευθεί με ποσοτικό PCR (Q-PCR). Σίγηση σημαντικών γονιδίων που επηρεάζονται κατά την διάρκεια της αβιοτικής καταπόνησης θα γίνει προσπάθεια να πραγματοποιηθεί με τη διαδικασία του σταθερού μετασχηματισμού. Θα γίνει μελέτη του μεταγραφόματος (transcriptome) αλλά και των γλυκοπρωτεϊνών του κυτταρικού τοιχώματος που εμπλέκονται στην ξηρασία, έλλειψη οξυγόνου στο ριζικό σύστημα (watering loging), αλλά και ψύχος μέσω του χαρακτηρισμού της φυσιολογικής σημασίας των υδροξυλασών 4 της προλίνης (P4Hs) όπως οι Αραβινογαλακτάνες (AGPs) μέσω western blot analysis κλπ. Σπορόφυτα ελιάς κατάλληλης ηλικίας θα εμβολιαστούν. Στο σημείο εμβολιασμού του υποκειμένου θα αφαιρεθεί ορθογώνιο τεμάχιο φλοιού. Απο το εμβόλιοφόρο βλαστό θα αφερεθεί τεμάχιο φλοιού με περισσότερους τον ένα οφθαλμούς με τις ίδιες διαστάσεις του υποκειμένου. Ο εμβολιοφόρος βλαστος θα εφαρμοστεί επί του υποκειμένου, στο σημείο όπου αφαιρέθηκε το τεμάχιο φλοιού με καλό δέσιμο. Μετά από τον απαιτούμενο χρόνο που το εμβόλιο (μόσχευμα) θα έχει αναπτυχθεί, το δενδρύλιο θα εξαχθεί. Το τμήμα της βάσης μοσχευμάτων μήκους περίπου 14cm θα εμβαπτιστεί σε διάλυμα 4000ppm ιωδολυλοβουτυρικού οξέος για 5sec και θα τοποθετηθούν σε κασσάκια σε μίγμα 1:1 λίτη/τύφρης για να ριζοβολήσουν σε κλειστώ χώρο. Τα μοσχεύματα μετά την ριζοβολίασει θα μεταφυτευτούν σε γλάστρες σε σκιαζόμενο μέρος για σκληραγώγηση.
Οι διασταυρώσεις, οι οποίες ήδη εκτελούνται στο ΜΑΙΧ, θα χρησιμοποιήσουν την κλασσική μέθοδο της προστασίας των κλαδιών σε κατάσταση ανθοφορίας με ειδικές σακούλες ενώ η επαλήθευση τους στην F1 γενιά των 100-150 σποροφύτων που θα παραχθούν ανά διασταύρωση θα γίνει με την χρήση μοριακών δεικτών SSRs.
Ανάλυση και χαρακτηρισμός των γονιδίων που εμπλέκονται στη βιοσύνθεση της ελευρωπαΐνης θα γίνει με deep sequencing και βιοπληροφορική ανάλυση των γονιδίων (ESTs) που εκφράζονται υψηλότερα σε ανώριμους ιστούς με βάση τα αποτελέσματα. Για τη διερεύνηση της δυνατότητας χρήσης των γονιδίων αυτών ως μοριακών δεικτών συνδεδεμένων με την περιεκτικότητα των ελαιόκαρπων σε ελευρωπαΐνη, θα συλλεχθούν ελαιόκαρποι διαφόρων σταδίων ωρίμανσης από τις υπό μελέτη ποικιλίες από τους οποίους θα εκχειλισθούν αφενός οι φαινολικές ενώσεις και αφετέρου ολικό RNA που θα χρησιμοποιηθεί για τη μέτρηση των επιπέδων έκφρασης των βιοσυνθετικών της ελευρωπαΐνης γονιδίων με την τεχνική της real time PCR. Τα υποψήφια γονίδια θα αναλυθούν in silico με τη βάση δεδομένων των αλληλουλιχιών του γονιδιωματικού DNA της ελιάς. Ακολούθως, με συγκριτική γονιδιωματική και υπολογιστική ανάλυση ο κατάλογος των υποψηφίων γονιδίων θα ελαττωθεί με βάση την υψηλή ομολογία με σχετικά γονίδια από άλλα φυτικά είδη της τάξης Gentianales που αποδεδειγμένα συμμετέχουν στη βιοσύνθεση σεκοϊριδοειδών.
Η μέθοδος της Οργανοληπτικής εξέτασης των παρθένων ελαιολάδων προσδιορίζεται επακριβώς και λεπτομερώς στα θεσμικά κείμενα του Διεθνούς Συμβούλιο Ελαιολάδου και της ΕΕ. Η εξέταση θα γίνει σε διαπιστευμένο από αρμόδια αρχή Οργανοληπτικό Εργαστήριο (και ενδεχόμενα αναγνωρισμένο από το Διεθνές Συμβούλιο Ελαιολάδου) από κατάλληλα εκπαιδευμένη Ομάδα 8 τουλάχιστον δοκιμαστών, επικεφαλής της οποίας (panel supervisor), θα είναι άτομο με πολύ μεγάλη εμπειρία και εκπαίδευση στα θέματα της οργανοληπτικής αξιολόγησης. H οργανοληπτική εξέταση θα έχει στόχο τα οργανοληπτικά χαρακτηριστικά και τον εντοπισμό προσδιορισμό της έντασης των θετικών ιδιοτήτων (φρουτώδες, πικρό και πικαντικό) και των ελαττωμάτων (ατροχάδο/μούργα, μούχλα, κρασώδες, ταγγό, κλπ) των παρθένων ελαιολάδων. Επικοινωνιακές ενέργειες θα υλοποιθουν, οι οποίες θα επιλεγούν, σύμφωνα με το στοχοθετούμενο κοινό, δίνοντας έμφαση στην όσο το δυνατόν περισσότερο αποτελεσματική διάχυση της πληροφόρησης. Για το λόγο αυτό θα χρησιμοποιηθούν τόσο οι παραδοσιακές μέθοδοι επαφής με τα κοινά-στόχος, όπως τα έντυπα Μέσα, όσο και σύγχρονα εργαλεία, όπως το Διαδίκτυο. Στόχος των Δημοσίων Σχέσεων είναι η κατανόηση και η αποδοχή των νέων δεδομένων, τα οποία θα δημιουργηθούν με την ολοκλήρωση του έργου.
Όσον αφορά τις πρακτικές ελαιοποίηση που εφαρμόζει το ελαιουργείο θα εφαρμοσθούν διάφορες ορθές πρακτικές. Προς αυτήν την κατεύθυνση, κατά την παράδοση των ελαιόκαρπων από τους παραγωγούς στο ελαιοτριβείο, αυτοί θα αποθηκεύονται σε παλετοκιβώτια για περίπου 2-3 ώρες, τα όποια διαθέτουν κλιματιζόμενο θάλαμο με μέγιστη θερμοκρασία τους 16οC. Μέσω αυτής της καινοτόμας πρακτικής, διαφυλάσσεται η ποιότητα των καρπών μέχρι την περαιτέρω επεξεργασία τους. Κατόπιν, οι καρποί θα μεταφέρονται με αναβατόριο αρχικά στο αποφυλλωτήριο και κατόπιν ξεκινά η διαδικασία πλύσης σε τρία διακριτά στάδια. Το νερό το όποιο θα χρησιμοποιείται για τις πλύσης είναι ανανεώσιμο αλλά και απολυμασμένο με την χρήση UV, καθώς επίσης και με την ανά τακτά χρονικά διαστήματα προσθήκης ασκορβικού οξέως σε ποσότητα 0.004%. Έπειτα οι καρποί με την βοήθεια διάταξης ανεμιστήρα θα στεγνώνονται. Ακολουθεί παραλαβή των ελαιόκαρπων από ταινιόδρομο μήκους 3 μέτρων, μέσω του οποίου με την βοήθεια ανθρώπινου δυναμικού θα απομακρύνονται τυχών ξένα σώματα και ελαττωματικών καρπών. Αφού οι καρποί ζυγιστούν σε ηλεκτρονικό ζυγό, θα ακολουθεί μεταφορά αυτών στον σπαστήρα-αποπυρηνωτή όπου με σχετική διάταξη θα αποφασίζεται κατά περίπτωση η αναλογία καρπών που θα τους αφαιρεθεί το κουκούτσι. Κατόπιν, με μονοπόμπα μεταφέρεται η πάστα ελιάς σε δύο υπάρχοντες μαλακτήρες χωρητικότητας 300 κιλών ο καθένας. Επίσης, το ελαιοτριβείο σχεδιάζει έναν κατακόρυφο μαλακτήρα χωρητικότητας 120 κιλών όπου θα υπάρχει η δυνατότητα λειτουργίας του σε κενό αέρος. Η καινοτόμα αυτή βελτίωση θα οφείλεται στην λειτουργία ψύκτη (chiller) του νερού κυκλοφορίας κυρίως στους μαλακτήρες, επομένως θα είναι δυνατή η μεγιστοποίηση της ακρίβειας της θερμοκρασίας μάλαξης ανεξάρτητα των εξωτερικών θερμοκρασιών καρπών- περιβάλλοντος.
Επιπλέον, η ικανότητα του κατακόρυφου μαλακτήρα να μαλάσει και κλάσμα της δυναμικότητας του με την ίδια αποτελεσματικότητα, τον καθιστά εξαιρετική επιλογή για τα σχετικά πειράματα ελαιοποίησης της παρούσας ερευνητικής πρότασης.